A chromosome-scale genome of Berberis wilsoniae reveals the evolution and chromosomal organization of benzylisoquinoline alkaloid-related genes金花小檗染色体水平基因组揭示苄基异喹啉生物碱相关基因的演化与染色体排布特征摘要本研究组装得到金花小檗Berberis wilsoniae染色体水平基因组为苄基异喹啉生物碱相关基因研究提供基础资源。通过比较基因组学、生物碱谱以及转录组分析揭示了该物种谱系特异性的基因重排特征并发现其小檗碱相关代谢过程在根中优势表达为开展小檗科与毛茛目植物的特化代谢及进化基因组学研究奠定基础。1 引言植物次生代谢产物在植物防御、生态互作以及药物开发中发挥重要作用Upadhyay 等。其中苄基异喹啉生物碱BIA是一类重要特化代谢物广泛分布于基部真双子叶植物。该类化合物具有多样药理活性包括抗菌、抗炎以及抗肿瘤活性Hagel Facchini。代表性 BIA 类化合物包括小檗碱、吗啡、可待因、罂粟碱多数主要由毛茛目植物合成Tian 等。近年来多种 BIA 合成植物罂粟、黄连、黄檗、千金藤等的高质量基因组与多组学比较数据集相继发表极大推动了人们对 BIA 生物合成及其演化分化的认知。已有比较基因组研究表明BIA 代谢能力分散在多个植物谱系涵盖毛茛目、无患子目、Proteales山龙眼目以及木兰类植物说明 BIA 生物合成既存在谱系特异性分化也发生趋同进化Chen 等Liu 等Pei 等Liu 等Liu 等Xu 等Chen 等。目前已经解析 BIA 生物合成多条关键酶促步骤包括柯劳灵-N-甲基转移酶CNMT、小檗碱桥酶BBE以及多种 O-甲基转移酶OMT如去甲柯劳灵 6-O-甲基转移酶6OMT、3′-羟基-N-甲基柯劳灵 4′-O-甲基转移酶4′OMTFacchini 等Choi 等Chen 等Liu 等Wu 等Shan 等。尽管该通路核心生化反应已有较多研究但不同植物类群中这些合成基因的演化模式仍尚不明确。毛茛目属于真双子叶植物中较早分化的类群同时也是 BIA 物质最为丰富的植物目之一Xu 等Group 等。该目下罂粟科、毛茛科、小檗科多个物种均可合成大量具有药用价值的 BIA 类化合物Xu 等Aalinezhad 等Muhammad 等。其中小檗属植物可大量积累原小檗碱型生物碱 —— 小檗碱该物质兼具抗菌、抗炎、降血糖、心脏保护等多种药理活性Liu 等Fatima Hashmi 等Muhammad 等。虽然小檗属药用价值由来已久但相较于罂粟、黄连这些模式 BIA 合成植物小檗科基因组资源仍然匮乏。因此小檗属中 BIA 合成基因的基因组组成、演化历史、染色体排布模式仍有待解析。为解析毛茛目中 BIA 合成基因的演化规律本研究选取金花小檗Berberis wilsoniae作为研究对象开展基因组水平分析。本研究整合 PacBio HiFi、Hi-C 与 Illumina 测序数据组装获得金花小檗高质量染色体水平参考基因组。结合比较基因组、转录组分析与系统发育重建系统鉴定 BIA 生物合成相关基因家族解析不同类群中 BIA 相关基因的复制模式与基因组排布特征。本研究不仅为金花小檗小檗碱代谢研究提供基因组资源也为理解毛茛目防御型次生代谢通路的演化提供新的比较基因组学证据。详细材料与方法见支持信息部分。2 结果与讨论2.1 基因组组装与比较基因组概况为解析金花小檗中小檗碱及其相关 BIA 代谢利用 PacBio HiFi、Hi-C 以及 Illumina 短读长数据构建染色体水平参考基因组。kmer 分析预估基因组大小约 1.02 Gb杂合度中等重复序列占比较高提示该基因组复杂度较高。最终组装基因组大小 1228.47 Mbcontig N50 为 76.96 Mbscaffold N50 为 87.57 Mb99.16% 组装序列锚定到 14 条染色体上图 1。多项独立指标证明组装质量可靠HiC 互作热图显示清晰的染色体互作模式Illumina 读段比对率 99.55%Merqury 评估一致性质量值 QV48.47BUSCO 评估保守基因完整度 97.5%附图、附表。重复序列注释结果显示转座元件占基因组 44.83%以 LTR 反转录转座子为主。本研究注释得到 50 808 个蛋白编码基因以及多类非编码 RNA。以上结果说明金花小檗基因组组装连续性与完整度高可作为生物碱合成基因挖掘与比较基因组分析的可靠参考基因组。金花小檗的基因组演化、组织特异性小檗碱积累与转录组分化A. Circos 图展示金花小檗基因组的染色体模式图、转座元件TE密度、简单序列重复SSR密度、基因密度、GC 含量以及基因组内共线性区块。 B. 韦恩图展示 5 个代表性物种金花小檗、淫羊藿、黄连、罂粟、耧斗菜共有及物种特有基因家族。 C. 基于 OrthoFinder 得到的 12 个代表性被子植物的直系同源基因家族构成。 D. 基于严格单拷贝直系同源基因构建的物种系统发育树、分化时间以及基因家族扩张 / 收缩情况。蓝色条为 95% 最高后验密度区间分支上数字代表扩张 / 收缩的基因家族数目。地质年代缩写Jur. 侏罗纪Cre. 白垩纪Pal. 古近纪N. 新近纪Q. 第四纪。 E. 利用靶向 LC–MS/MS 定量检测根、茎、叶组织中的小檗碱。彩色连线连接同一个生物学个体的不同组织空心圆与误差棒代表平均值 ± 标准差。数值经过空白校正以组织干重进行归一化并采用对数坐标轴展示。组织间差异采用重复测量单因素方差分析检验。 F. 叶、茎、根转录组的主成分分析PCAPC1、PC2 分别解释 79.04% 和 10.7% 的变异。 G. 种内与种间共线性基因对的同义替换率Ks分布反映金花小檗的复制历史及其与代表性物种间的分化情况。本研究进一步对比金花小檗与其他被子植物的基因组特征。直系同源分析结果表明金花小檗保留与近缘物种共有的保守基因组框架同时拥有物种特有的基因组分。在本研究所选取的代表性物种中金花小檗、淫羊藿、黄连、罂粟和耧斗菜共有 10116 个基因家族图与此同时金花小檗存在自身特有的基因家族说明其基因组是在共同祖先框架基础上改造演化而来而非产生大量全新基因。基于严格单拷贝直系同源基因构建的系统发育树为解析基因家族动态变化提供演化背景图。金花小檗基因组一个显著特征扩张的基因家族数量远多于收缩的基因家族。在分析的 12894 个基因家族中5793 个发生扩张633 个发生收缩6468 个保持相对稳定图。功能富集结果显示扩张基因家族主要富集于次生代谢、防御相关过程、超敏反应、伤口应答以及细胞程序性死亡。这些功能类别与 BIA 作为植物防御性化合物的生物学角色一致说明金花小檗基因组在一定程度上受到防御与特化代谢相关选择压力的塑造。Ks 分析也支持上述结论。共线性基因对的同义替换率分布存在明显峰值说明金花小檗谱系发生过显著的基因复制事件或复制基因保留事件图。与近缘物种的比较还发现随着系统发育距离增加Ks 值随之升高。综上结果表明金花小檗拥有被子植物保守的基因组骨架同时在防御与次生代谢相关功能上发生谱系特异性扩张为其生物碱合成能力奠定演化基础。2.2 组织特异性生物碱积累与转录组分化为探究金花小檗生物碱积累是否存在组织差异测定根、茎、叶总生物碱含量并采用靶向 LC–MS/MS 对小檗碱进行定量图附图。本研究进一步考察该代谢差异是否伴随全局性转录组分化。9 个样本的 RNA 测序主成分分析可将根、茎、叶清晰分为三组图。第一主成分解释 79.04% 变异第二主成分解释 10.70% 变异合计解释总变异的 89.74%。该结果说明组织类型是本数据集转录组分化的最主要来源。叶片生物学重复聚集紧密重复性高根样本也形成稳定类群仅一个重复沿第二主成分出现轻微偏移茎样本同样独立分组但离散程度略大。结果表明三种组织不仅生物碱含量存在差异整体转录状态也显著不同。代谢组与转录组联合数据提示根并非单纯被动储存生物碱的组织。如果仅生物碱含量高、转录组无明显分化则可解释为被动积累但根同时具备高生物碱含量和独特的基因表达谱说明根是生物碱相关代谢主动分化的主要组织。这不代表全部合成步骤都局限在根内也不排除物质转运与转录后调控的作用。但综合证据表明在金花小檗的组织层面生物碱代谢网络中根处于核心地位。该结果为后续合成基因分析提供重要依据。根同时富集生物碱且转录组特征最突出是挖掘小檗碱及相关 BIA 候选基因最有价值的组织。与此同时叶片生物碱含量也相对较高说明该物种的组织特化是数量差异型而非绝对的组织特异性。总体而言组织层面的结果建立了清晰的化学与转录组差异为候选基因挖掘确定生物学背景。小檗碱的定量特征与基于紫外检测的总生物碱谱并不一致说明金花小檗不同组织的生物碱差异并非只是总丰度的变化不同组织中各类 BIA 单体的相对占比存在区别。因此靶向小檗碱定量可以更直接地辅助解读 BIA 候选基因在根中的富集表达后续研究可拓展更多 BIA 的广谱代谢组检测完整解析该物种组织特异性生物碱组成。2.3 小檗碱生物合成候选基因为挖掘金花小檗中参与小檗碱及其相关 BIA 合成的候选基因筛选根相对于茎、叶均上调表达的基因结合功能注释进行联合分析附图附表。该策略共筛选得到 10 个候选基因包含少量核心候选基因以及参与 BIA 通路主要步骤的多个辅助基因。由于根的总生物碱含量最高相比于在各组织广泛低表达的基因根富集高表达基因更可能参与通路的活性合成过程。这套候选基因集合建立了组织生物碱积累与前面基因组分析结果之间的直接关联。所有候选基因中信号最显著的是 CNMT 同源基因 f11G026860。在两组组织比较中该基因均在根中显著上调是转录组数据中最突出的单一候选基因。CNMT 参与 BIA 通路早期甲基化步骤该基因的重要性与已有文献报道一致。因此 Bwi11G026860 是目前金花小檗中最有可能承担关键合成功能的候选基因。该结果的亮点不仅在于该基因高表达而是在大量复制保留的同源基因背景下这一个拷贝的表达优势非常突出。数据提示并非所有 CNMT 同源拷贝均等参与代谢而是特定拷贝在生物碱含量最高的组织中优先发挥功能。候选基因集合第二个显著特征多个 OMT 同源基因呈现明显的根偏好表达。部分 OMT 候选基因在根中高表达在叶、茎中表达极低另一些则呈现梯度模式根表达最高茎中等叶片最低。虽然各个基因表达模式细节有差异但整体趋势一致。BIA 通路的甲基化相关步骤在根中活性最高。该结果说明根富集型生物碱积累并非依靠单个基因而是由一组以甲基化功能为核心的表达模块共同驱动。同时不同 OMT 同源基因表达谱存在差异提示这些保留的基因拷贝之间发生功能分化而非简单的功能冗余。其余候选基因说明并非通路所有步骤都同等局限于根。BBE 同源基因与两个 NCS 同源基因表现为根偏好或根、茎共表达不像 CNMT 和部分 OMT 基因那样强烈富集于根。说明候选基因至少分为两类表达模式一类强根富集与生物碱最高积累组织紧密关联另一类在根、茎均可发挥功能。该模式具备生物学合理性部分通路步骤集中在终产物大量积累的组织另一些步骤则可在更多器官中发挥作用。2.4 BIA 相关基因的演化保守性与分化为从演化角度解析金花小檗候选基因比较多个代表性毛茛目物种的主要 BIA 相关基因家族解析其系统发育关系与染色体分布。BIA 合成酶基因的比较染色体分布与局部基因簇排布见图扩张基因家族功能富集结果见图采样植物代表性形态特征见图。结果表明金花小檗筛选得到的候选基因归属于已知 BIA 通路家族并非来源于更大酶超家族中无关分支。说明金花小檗小檗碱生物合成依托一套与其他 BIA 合成植物共享的保守催化框架。因此该物种的特殊性大概率不是通路起源本身而是该谱系内特定基因家族的保留、扩张与表达模式重塑。对 CNMT、BBE、OMT、CYP80 类蛋白的扩大系统发育分析显示不同基因家族演化模式并不相同附图。CNMT 类候选基因保守性最强与已报道功能 CNMT 基因聚为一支同时在所有核心候选基因中根富集表达最强提示该步骤是通路中相对稳定的组成部分。与之相比OMT 家族演化模式更复杂分化为多个亚群分别承担不同甲基化功能家族内部分化程度更高。在 OMT 类家族中金花小檗候选基因分散在 6OMT 和 4′OMT 参考分支附近提示 OMT 功能发生多样化。本研究也在金花小檗中鉴定到 CYP80 同源基因部分候选基因在系统发育树上与已表征 CYP80B 蛋白亲缘较近但无法明确判定为 CYP80B1 的直系同源基因。综上可见BIA 通路部分区段演化保守另一些区段在谱系内部及谱系之间发生更大程度分化。染色体分布特征进一步印证上述结论。金花小檗的 BBE 同源基因与 4′OMT 同源基因分布在染色体不同位置没有形成明显局部基因簇而 6OMT 类基因排布更集中9 号染色体上存在两个紧密连锁的基因提示该家族发生局部复制保留。这种差异说明同一代谢通路的基因不一定拥有相同基因组排布模式部分家族基因分散分布另一些存在局部扩张证据。这表明金花小檗 BIA 相关基因的演化并非协同统一的过程通路不同步骤的基因发生差异化变化。BIA 基因家族这种染色体排布差异对通路演化与调控具有潜在生物学意义。金花小檗 BIA 相关基因并未形成单一紧凑的代谢基因簇而是混合排布模式6OMT 家族存在局部复制保留BBE 与 4′OMT 基因分散分布。9 号染色体上两个 6OMT 同源基因紧密连锁可能源于串联复制为甲基化相关步骤提供拷贝数增加或局部共调控的基因组基础。与之相对BBE 与 4′OMT 基因分散排布提示通路其余步骤更可能依靠反式作用转录调控协同而非依靠物理成簇。结合只有部分 BIA 候选基因根富集表达的特征说明金花小檗小檗碱合成由两类机制共同塑造特定基因家族的局部串联复制以及物理上分散的通路基因的组织特异性调控。跨物种比较进一步印证该结论。金花小檗、淫羊藿、黄连、罂粟之间BBE、4′OMT、6OMT 基因的拷贝数与基因组排布各不相同。部分物种存在成簇拷贝另一些仅保留少数分散拷贝不同家族扩张程度也存在差异。结果提示近缘物种可以拥有相同的核心生化通路但支撑通路的基因在基因组上的排布方式差异巨大。总体而言系统发育与比较基因组证据表明金花小檗小檗碱相关代谢是保守性与分化性的结合体。核心酶促框架与其他 BIA 合成类群共享但特定基因家族的拷贝数、染色体排布与表达模式发生谱系特异性重塑。结合基因组、组织化学与表达分析结果证明金花小檗 BIA 生物合成是在祖先共有代谢框架基础上改造形成并非从头诞生全新通路。Data Availability StatementAll raw sequence data have been deposited in the National Genomics Data Center (NGDC;BioProject - CNCB-NGDC) under BioProject accession number PRJCA060092 and GSA accession number CRA040064. The genome assembly and annotation files are available in ScienceDB atChromosome-level genome of Berberis wilsoniae.